Les techniques diagnostiques fongiques actuellement acceptées, comme la culture, la biopsie et la sérologie, manquent de rapidité et d’efficacité Des méthodes de diagnostic plus récentes, telles que les réactions en chaîne par polymérase PCR, ont le potentiel d’améliorer les diagnostics fongiques de manière plus rapide et spécifique Les données préliminaires indiquent que lorsque les tests de diagnostic fongiques basés sur la PCR guident la thérapie antifongique, ils peuvent réduire la mortalité des patients et réduire le traitement antifongique inutile, améliorant les coûts associés au traitement et évitant la toxicité. La corrélation entre ces locus et l’échec clinique doit également être étudiée. De plus, les études futures doivent se concentrer sur la mise en œuvre des techniques de PCR dans la prise de décision clinique et sur leur combinaison avec d’autres tests diagnostiques. de grandes études prospectives, est nécessaire pour permettre l’adoption de ces dosages

Les techniques actuelles de diagnostic fongique, à savoir culture, histologie et sérologie, manquent d’efficacité et retardent considérablement le diagnostic Malgré de nouveaux agents antifongiques, qui améliorent considérablement la mortalité, une nouvelle diminution de la mortalité dépend de méthodes de diagnostic plus rapides et plus sensibles. traitement en quelques heures pour candidose invasive IC entraîne une diminution statistiquement significative de la mortalité [1, 2], et une tendance similaire est observée dans l’aspergillose invasive IA [3] Réaction en chaîne polymérase Les techniques de diagnostic PCR peuvent rapidement détecter de nombreuses espèces fongiques De plus, ils peuvent offrir une fenêtre thérapeutique encore plus précoce en identifiant les infections fongiques quelques jours avant le début des résultats de culture positifs [4-6] Ici, nous fournissons au clinicien les limites des méthodes de diagnostic fongiques traditionnelles et centrons notre attention sur Diagnostic basé sur la PCR de IA et IC Nous nous concentrons sur des études évaluant la PCR Dans chaque section, les tableaux comprennent des études prospectives en anglais qui ont utilisé les critères EORTC / MSG de l’Organisation Européenne de Recherche et de Traitement du Cancer / Mycoses pour les infections fongiques. [7] Nous avons recherché les termes « PCR », « Candida » et « Aspergillus » dans PubMed à partir de 2002 l’année où les critères EORTC / MSG ont été établis jusqu’à la période de préparation des manuscrits Nous avons analysé les contributions originales et non les résumés des réunions scientifiques ou commentaires d’experts Pour chaque étude diagnostique incluse dans nos tableaux, nous avons calculé les probabilités prétest et posttest en définissant les vrais positifs comme tous les cas avérés d’infection fongique et les vrais négatifs comme tous les cas de CI ou IA qui ne satisfaisaient pas l’EORTC / Critères MSG pour l’infection fongique invasive Études qui ne sont pas basées sur la PCR, telles que la désorption ionisée assistée par matrice spectrométrie de masse à temps de vol ation [8] et hybridation in situ par fluorescence d’acide nucléique peptidique [9], ne sont pas dans le champ de cette revue

LES DÉFICIENCES DES MÉTHODES DE DIAGNOSTIC FONGIQUE APPROUVÉES PAR ADMINISTRATION ALIMENTAIRE ET MÉDICAMENTEUSES ACTUELLES

Pour les IC, l’hémoculture, l’histologie et les méthodes sérologiques identifiant le β-d-glucane comme composant de la paroi cellulaire fongique sont les méthodes diagnostiques couramment acceptées. La sensibilité des flacons d’hémocultures disponibles dans le commerce (aérobie, anaérobie et mycologie) montre une variabilité significative et dépend du type de culture cultures anaérobies sont seulement 10% sensibles [10], la taille de l’inoculum, et le système de culture sanguine Une étude évaluant les hémocultures avec Candida inocula similaires à la plupart des cas cliniques de candidémie rapporté 57% de sensibilité [11 ] De plus, les hémocultures nécessitent au moins 24-48 heures pour une identification simple spécifique au genre, 24-72 heures supplémentaires pour la détermination des espèces et plusieurs jours pour finaliser un résultat négatif [12] En outre, les espèces non-Candidaalbicans nécessitent plus d’incubation [13], avec Candida glabrata nécessitant significativement plus de temps que C albicans [10] En plus de la culture, le 1,3 β-d-glucane est un diagnostic utile. djunct [14] La sensibilité et la spécificité du test sont respectivement de 768% et 853% [14]; cependant, il est non spécifique, car il se trouve dans de nombreuses parois cellulaires fongiques, telles que celles des espèces Fusarium, Acremonium, ou Pneumocystis jirovecii, et même certains aliments [14] De plus, l’interprétation du β-d-glucane chez les enfants peut être difficile en raison des valeurs faussement positives chez les patients qui sont simplement colonisés [15] Pour le diagnostic de l’IA, le dosage immuno-enzymatique du galactomannane un sucre constituant des parois cellulaires des espèces Aspergillus et autres champignons a une sensibilité et une spécificité globale de 64% -71% et 81% -95%, respectivement [16] Cependant, la sensibilité est élevée chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques 72% et chez les receveurs de greffe de moelle osseuse 82%, mais elle est diminuée chez les receveurs de transplantation 22% [17] la sensibilité du test est également meilleure chez les espèces non-Aspergillus fumigatus, avec une sensibilité de 13% pour A fumigatus et de 49% pour les espèces non-Afumigatus P & lt; 0001 [18] De plus, les valeurs faussement positives ou faussement négatives ue sont une considération, car certains antibiotiques [19, 20], une infection fongique due aux espèces Histoplasma et même l’ingestion de certains aliments [21] peuvent augmenter les taux de galactomannane, alors qu’un traitement antifongique peut rapidement diminuer les taux de galactomannane [22] a des caractéristiques différentes chez les enfants atteints de cancer ou de greffe de moelle osseuse Plus spécifiquement, la sensibilité et la spécificité du test ne sont respectivement que de 32% et 98% et la valeur prédictive positive PPV et la valeur prédictive négative NPV respectivement de 70% et 92% [23]

DOSAGES BASÉS SUR LA PCR POUR LE DIAGNOSTIC D’INFECTIONS FONGIQUES

Description et défis des tests diagnostiques fongiques par PCR

pour discuter de leurs aspects techniques importants Les échantillons cliniques tels que le sang ne contiennent souvent qu’un petit nombre de cellules fongiques; Les méthodes d’extraction doivent lyser toutes les cellules fongiques disponibles pour maximiser la quantité d’ADN Une autre approche qui pourrait augmenter la quantité de cellules implique l’utilisation de la PCR sur des échantillons préincubés [24, 25] Cependant, la préincubation nécessite du temps pour la croissance cellulaire. Après l’extraction de l’ADN, les techniques de purification éliminent les molécules autres que l’ADN fongique qui interfèrent avec la réaction de la PCR, par exemple, l’hémoglobine inhibe l’ADN polymérase Taq [26] En outre, l’ADN humain peut héberger des séquences Les chercheurs exploitent les différences entre l’ADN humain et fongique pour créer des tests de purification enrichissant pour l’ADN fongique et excluant l’ADN humain [27] Une approche intéressante est basée sur différents motifs de méthylation entre les humains et les champignons Par exemple, les protéines d’essai spécifiques se lient préférentiellement à l’ADN microbien non méthylé, à Cependant, cette technique abaissait la sensibilité du test basé sur la PCR lorsqu’il était utilisé pour le diagnostic d’IA chez les patients neutropéniques [27] Pour contourner les techniques d’extraction et de purification de l’ADN laborieuses et longues, les sondes et les plateformes évoluent détection de séquences fongiques En plus des sondes Taqman disponibles dans le commerce et des plateformes PCR en temps réel LightCycler, la technologie Luminex est une alternative [28] Ce test PCR multiplex en tandem permet 12 PCR simultanées détectant plusieurs cibles ADN dans un seul instrument à haute sensibilité. 29] La contamination par un ADN fongique cliniquement non pertinent est l’un des facteurs les plus importants empêchant l’adoption de tests PCR [30], en particulier lors de l’utilisation d’échantillons non stériles ou d’amorces non spécifiques. ] Une autre approche consiste à isoler l’ADN des formes fongiques invasives, mais pas de Par exemple, un tel essai utilise un protocole d’extraction spécial isolant préférentiellement l’ADN des espèces invasives d’Aspergillus mais pas des conidies colonisatrices [32] Il est à noter qu’il existe peu de données sur la forme prédominante des organismes Aspergillus circulants Ces types circulent durant le processus d’infection gériatrique. Le type d’échantillon sanguin peut également affecter la sensibilité du test. Pour IC, le sang total est supérieur au sérum [33], tandis que pour IA, le sang total et le sérum ont des sensibilités égales. Une explication est que les cellules Candida sont phagocytées par les neutrophiles, alors que les Aspergillus hyphae sont grandes et nécessitent une destruction extracellulaire [35] Ainsi, les analyses de sang total incluant les neutrophiles contiendront vraisemblablement de plus grandes quantités d’ADN de Candida comparé au sérum. La purification de l’ADN fongique est suivie par l’amplification de séquences spécifiques par la construction d’amorces Le cluster de gènes de l’ARNr de l’ARN ribosomique est une cible populaire et contient les 18 régions de Svedberg S, espaceur transcrit interne ITS 1, 58S, ITS2 et 28S. Ce groupe est traduit en petites et grandes sous-unités ribosomales de l’ARNr. Les cellules fongiques contiennent de multiples copies de ce groupe, ce qui augmente la sensibilité du test. Pour identifier> 1 genres fongiques, les amorces doivent se lier à des séquences qui conservent des zones phylogénétiquement conservées, tandis que les tests qui détectent des espèces fongiques spécifiques doivent utiliser des amorces Notons que le groupe de gènes ARNr contient à la fois des zones conservées et hypervariablesAprès amplification de l’ADN, les amplicons peuvent être détectés et quantifiés. Dans les techniques plus anciennes, les amplicons subissent une manipulation postamplification, comme le polymorphisme de longueur de fragment de restriction. l’analyse ou le transfert de Southern, entraînant des retards importants et une exposition prolongée à [37-39] De nouvelles plateformes de PCR en temps réel utilisent des sondes fluorescentes en même temps que la PCR [40] Pour une description plus détaillée des techniques d’amplification et de détection de l’ADN PCR, se référer au Tableau 1. Bien que les techniques de détection de l’ARN dépassent le but de notre revue, l’isolement de l’ARN pourrait être avantageux, car il est produit en plus grande quantité, augmentant ainsi la sensibilité du test. une technologie émergente pour le diagnostic fongique [41] Contrairement aux dosages classiques basés sur la PCR, la NASBA détecte l’ARN au lieu de l’ADN et fonctionne à une température constante de 41 ° C [42]. qui peut être détecté par des sondes fluorescentes à balises moléculaires

ensemble d’amorces est utilisé; la séquence amplifiée est liée à une sonde fluorescente qui émet de la lumière lorsqu’elle est liée au produit amplifié. Les sondes se lient pendant l’amplification; peut quantifier l’échantillon initial; l’amplification peut être surveillée en temps réel; débit élevé et faible risque de contamination; cyclisme ultrarapide; confirmation de l’amplification spécifique par analyse de la courbe de fusion; plus spécifique, sensible et reproductible Pas idéal pour le multiplexage, bien que le test multiplex soit possible; exige des compétences techniques et un soutien élevés; coût élevé de l’équipement 25K $ – 95K $ Méthode de détection PCR-ELISA Les produits de PCR amplifiés sont soumis à électrophorèse dans un gel puis transférés à une sonde de capture immobilisée émettant de la lumière ne nécessitant pas de manipulation postamplification, minimisant ainsi le risque de contamination. moins cher que le dosage PCR en temps réel; 10 à 100 fois plus sensible que la coloration au bromure d’éthidium. Temps de transfert des bandes électrophorées aux membranes Hybridation Le produit « sonde » de PCR se lie à la séquence complémentaire « cible »; la sonde est liée à divers types d’agents émettant de la lumière Plus sensible que l’électrophorèse sur gel d’agarose Pas aussi sensible que la PCR en temps réel; nécessite des conditions strictes pour la performance; nécessite une plus grande quantité d’ADN que la PCR, ce qui peut être une étape limitante; plus coûteux et plus lent que l’électrophorèse sur gel d’agarose Gel d’agarose Le bromure d’éthidium s’intercale dans les produits de PCR et traverse ensuite un gel sous l’influence d’un courant électrique Simple; pas cher mauvaise précision; faible sensibilité; non automatisé; discrimination fondée sur la taille seulement; la coloration au bromure d’éthidium n’est pas très quantitative. Le séquençage du produit PCR est traité puis séquencé La spécificité est élevée; permet la détection de nouvelles mutations Laborious; lente Technique Description Avantages Commentaires Méthode d’amplification de l’ADN PCR 1 paire d’amorces est utilisée, ce qui amplifie la séquence génomique cible Efficacité simple et efficace dépend de la spécificité des amorces; des produits non spécifiques peuvent être générés pour confondre les résultats PCR nichée 2 paires d’amorces différentes sont utilisées; 1 ensemble est une séquence amplifiée, et le 2ème ensemble est complémentaire de la séquence amplifiée par le 1er ensemble d’amorces plus spécifique que PCR; n’amplifie que les séquences spécifiques recherchées Risque de sursaturation du test avec des produits de PCR susceptibles de réagir de manière croisée; risque accru de dimérisation d’amorce; n’identifiera qu’un ensemble de pathogènes fongiques, pas une seule espèce spécifique. Seminested Identique à nested, mais la seconde paire d’amorces a 1 amorce identique à la première paire. Plus spécifique que PCR; amplifie uniquement les séquences spécifiques recherchées Idem que pour les paires d’amorces multiples multiplex PCR nichées; Septifast est un exemple d’analyse par PCR multiplex commercialisée. L’amplification rapide de séquences multiples conserve l’ADN matrice et minimise les dépenses; reconnaît de nombreux agents pathogènes à la fois Risque accru d’amorce-dimères; nécessite une optimisation laborieuse Temps réel 1 jeu d’amorces est utilisé; la séquence amplifiée est liée à une sonde fluorescente qui émet de la lumière lorsqu’elle est liée au produit amplifié. Les sondes se lient pendant l’amplification; peut quantifier l’échantillon initial; l’amplification peut être surveillée en temps réel; débit élevé et faible risque de contamination; cyclisme ultrarapide; confirmation de l’amplification spécifique par analyse de la courbe de fusion; plus spécifique, sensible et reproductible Pas idéal pour le multiplexage, bien que le test multiplex soit possible; exige des compétences techniques et un soutien élevés; coût élevé de l’équipement 25K $ – 95K $ Méthode de détection PCR-ELISA Les produits de PCR amplifiés sont soumis à électrophorèse dans un gel puis transférés à une sonde de capture immobilisée émettant de la lumière ne nécessitant pas de manipulation postamplification, minimisant ainsi le risque de contamination. moins cher que le dosage PCR en temps réel; 10 à 100 fois plus sensible que la coloration au bromure d’éthidium. Temps de transfert des bandes électrophorées aux membranes Hybridation Le produit « sonde » de PCR se lie à la séquence complémentaire « cible »; la sonde est liée à divers types d’agents émettant de la lumière Plus sensible que l’électrophorèse sur gel d’agarose Pas aussi sensible que la PCR en temps réel; nécessite des conditions strictes pour la performance; nécessite une plus grande quantité d’ADN que la PCR, ce qui peut être une étape limitante; plus coûteux et plus lent que l’électrophorèse sur gel d’agarose Gel d’agarose Le bromure d’éthidium s’intercale dans les produits de PCR et traverse ensuite un gel sous l’influence d’un courant électrique Simple; pas cher mauvaise précision; faible sensibilité; non automatisé; discrimination fondée sur la taille seulement; la coloration au bromure d’éthidium n’est pas très quantitative. Le séquençage du produit PCR est traité puis séquencé La spécificité est élevée; permet la détection de nouvelles mutations Laborious; lente Abréviations: ELISA, dosage immuno-enzymatique; PCR, polymerase chain reactionaCombine amplification et détection dans la même réaction Pas strictement catégorisé sous la section Méthodes d’amplification de l’ADNVoir Grand

Dosages de sang basés sur la PCR pour le diagnostic d’IC

Les tests basés sur la PCR pour le diagnostic de CI ont un seuil bas de détection de cellules fongiques et peuvent détecter aussi peu que 5 [43, 44], 3 [45-47], 2 [48, 49], 1 [50], ou même 022 cellules / mL [51], ce qui est comparable au seuil de détection des hémocultures [6, 43, 45, 46, 48-51] Fait à noter, plus de la moitié des cas de candidémie impliquent <1 cellule / mL, Par conséquent, l'un des principaux défis du diagnostic fongique par PCR est de surmonter ce fardeau. Toutefois, les tests basés sur la PCR mesurent l'ADN non seulement à partir de cellules viables, mais aussi à partir de cellules mortes ou même ADN en suspension dans le sérum En conséquence, les analyses de sang basées sur la PCR ont une sensibilité accrue, en particulier dans les cas de CI, comme la candidose hépatosplénique, pour lesquels les résultats de la culture sanguine sont traditionnellement négatifs [5, 53, 54]. Les tests basés sur l'ADN de Candida dans des échantillons sanguins indiquent une sensibilité pouvant atteindre 100% [38, 39, 43, 44, 47-49, 55] et spécificité qui est> 90% [37, 38, 43, 45, 46, 48, 49, 51, 56-58] Cependant, les VPP sont extrêmement variables [45, 51], la plupart des études rapportant des VPP d’environ 50 [39, 43, 44] [47, 49, 55, 57-59] Il est important de noter que les VAN sont plus constantes et varient de 88% à 100% [38, 43, 44, 47, 48, 55]. Les études ont centré leur évaluation sur les enfants et ont montré une sensibilité de 100%, une spécificité de 65% à 88%, une VPP de 445% à 454% et une VAN de 100% Bien que davantage d’études soient nécessaires, ces données préliminaires sont importantes. enfants Pris ensemble, ces résultats suggèrent que les tests basés sur la PCR sont plus utiles pour exclure plutôt que d’établir le diagnostic des résultats IC de ces études sont présentés dans le tableau 2

ec / PPV / NPV Westh et al [56] 2009 P, D Âge NM: 359 avec suspicion clinique de sepsis 1 Multiplex PCR en temps réel WB 30 5 18S, 58S 50/97/25/99 Von Lilienfeld-Toal et al [ 45] 2009 P, D Adultes: 70 avec HM et FN après chimiothérapie 1 Multiplex PCR en temps réel Se 3 10 ITS 0/97/0/985 Wellinghausen et al [46] 2009 P, D Adultes et enfants: 329 adultes et 55 enfants atteints de HM et d’immunodéficience et / ou séjour en USI 3 PCR en temps réel WB 3 5 adultes, 25 ou 14 enfants 18S 88/93/218/997 Badiee et al [48] 2009 P, Scr Adultes: 209 avec HM 1 PCR- ELISA WB 2 18S 100/95/875/100 Khlif et al [57] 2009 P, D Adultes et enfants: 110 à risque d’infection fongique invasive 1 PCR en temps réel WB 100 02 18S, ITS1, ITS2 81/96/906 / 91 Nested PCR 86/54/477/889 Louie et al [58] 2008 P, D Adultes: 76 à l’urgence, 33 à l’USI et 91 en médecine générale 1 PCR multiplex en temps réel WB 30 3 18S, 58S 50/99/50/989 McMullan et autres [51] 2008 P, Scr Adultes: 157 wi neutropénie dans l’unité de soins intensifs 1 PCR en temps réel Se 022 04 58S, 18S, ITS1, ITS2 70/100/100/977 Ribeiro et al [38] 2006 P, Scr Adultes et enfants: 193 avec HM sous traitement immunosuppresseur intensif 1 Régulier PCR WB NM 5 18S 100/92/176/100 Klingspor et Jalal [49] 2006 P, D Âge NM: 373 à risque de maladie fongique invasive 1 PCR en temps réel WB 2 5 18S 100/99/583/977 White et al [43] 2005 P, D Âge NM: 77 patients avec HM et neutropénie 1 PCR en temps réel WB 5 4 L18F, 18S 100/97/50/100 Ljungman et al [59] 2005 P, Scr Adultes: 20 avec HM , et 15 avec BMT autologue 1 PCR en temps réel WB NM 5 18S 333/93/50/933 Moreira-Oliveira et al [37] 2005 P, Scr Adultes: 225 avec durée de séjour> 15 d 1 PCR suivie d’ADN séquençage WB 10 5 ITS4, ITS5 72/98/886/936 Maaroufi et al [55] 2004 P, D Âge NM: 39 avec HM fébrile et 15 volontaires sains 1 PCR en temps réel Se 10 04 ITS86, ITS4 100/69 / 412/100 Blanc et autres [50] 2003 P, D Âge NM: 113 wi PCR en temps réel WB 1 5 18S 67/84/154/983 Tirodker et al 2003 [39] P, D Enfants: 70 en réanimation néonatale ou en soins intensifs pédiatriques avec suspicion de septicémie 1 PCR Se 200 02-05 18S 100/88/455/100 Maaroufi et al [44] 2003 P, D Âge NM: 61 avec HM ou cancer 1 PCR en temps réel WB 5 5 ITS86, ITS4 100/93/636/100 Dendis et al [47] 2003 P, D Enfants: 24 avec cancer et FN 1 PCR suivi par APLP / RFLP et séquençage WB 3 05 ITS2 100/75/445/100 Les résultats positifs sont définis comme des hémocultures positives pour les espèces Candida, considérant que les résultats vrais négatifs sont définis par l’absence de critères de l’encéphalose invasive par l’Organisation européenne pour la recherche et le traitement du cancer / Mycoses: Abrégés: APLP, polymorphisme de la longueur du produit d’amplification; BMT, greffe de moelle osseuse; D, diagnostic; ELISA, dosage immuno-enzymatique; ED, service d’urgence; FN, neutropénie fébrile; HM, malignité hématologique; Unité de soins intensifs, unité de soins intensifs; ITS, espaceur transcrit interne; NM, non mentionné; NPV, valeur prédictive négative; P, prospective; PCR, amplification en chaîne par polymérase; PPV, valeur prédictive positive; RFLP, polymorphisme de longueur de fragment de restriction; S, Svedberg; Scr, dépistage; Se, sérum; Sens, sensibilité; Spec, spécificité; WB, sang total Large Il n’y a pas d’études comparatives évaluant la culture et les modalités de PCR pour le diagnostic des infections fongiques et en particulier la candidémie due à des espèces fongiques 1, mais des tests basés sur la PCR peuvent être avantageux pour détecter plusieurs espèces en une seule. échantillon de sang Une étude a montré que seulement 53% des patients 4% des échantillons avec candidémie avaient une souche de Candida isolée en culture [60], alors que des études PCR récentes ont rapporté ≥2 souches de 185% des patients 5 sur 27 [61] ] et 333% des patients 4 de 12 [62] tests basés sur la PCR peuvent également jouer un rôle dans le suivi de l’efficacité du traitement antifongique et de la clairance de Candida dans le sang 2 études ont rapporté que 2 patients sur 4 et 16 sur 25 PCR positive après 14 jours de traitement antifongique est mort par la suite [6, 48] Il est important d’ajouter que les résultats de PCR sont persistants négatifs chez les individus en bonne santé et les patients atteints de vaginite à Candida ou de colonisation des voies respiratoires supérieures. ct ou urine [4, 62] Dans une autre étude, seulement 271% des patients colonisés ont eu un résultat de PCR positif; Cependant, aucun détail sur les sites de colonisation n’a été décrit. [48] De manière significative, seul un petit nombre d’études étudient la signification clinique des diagnostics basés sur la PCR pour les IC. Dans une étude, Lin et al [5] ont utilisé un test PCR. Pour guider l’utilisation du traitement antifongique préemptif chez les patients pédiatriques L’étude a inclus 42 patients fébriles avec tumeurs malignes et neutropénies neutrophiles, <05 × 109 cellules / L qui étaient âgées de moins de 15 ans. Dans cette étude, un traitement par l'amphotéricine B a été administré. aux patients avec un résultat de culture sanguine positif ou 2 résultats de PCR positifs séquentiels, selon la première éventualité L'étude n'incluait pas les sujets témoins, mais la mortalité associée à la candidémie était de 25%, un taux inférieur à celui habituellement rapporté dans la littérature.

Dosages par PCR de spécimens sanguins et non sanglants pour le diagnostic de l’IA

Dosages de sang basés sur la PCR peuvent détecter l’ADN des espèces Aspergillus une durée moyenne de 14 jours avant le diagnostic clinique de IA [63] PCR positivité peut également précéder les résultats positifs du dosage de galactomannane médiane, 17 jours; intervalle, 4-63 jours ou TDM positif, médiane, 8 jours; intervalle, 1-84 jours [64] Les dosages de sang basés sur la PCR pour la détection des espèces d’Aspergillus ont montré un large spectre de sensibilités allant de 36% à 100% [63, 65-69] D’importance, positivité d’un seul spécimen a un impact négatif sur la spécificité [64, 66], alors que la positivité à deux échantillons augmente la spécificité à> 90% [64, 66, 69, 70], probablement en diminuant les chances de contamination des échantillons ou de PCR simple. Les IA montrent une variabilité parmi les VPP, mais les VPN peuvent atteindre 100%, soulignant que les tests basés sur la PCR sont actuellement plus utiles pour exclure plutôt que confirmer le diagnostic d’AI pour un aperçu des études, se référer au Tableau 3

Année Conception Population / Condition Nombre de centres PCR Amplification et méthode d’identification Sens of Assay UFC / mL Échantillons Gène cible Échantillonnage en série de chaque échantillon Hummel et coll. [71] 2010 P, D Enfants et adultes n = 91 6 PCR nichée suivie de réelles temps PCR 1-5 pour imbriqué, 15 pour PCR en temps réel WB 18S 43/100/100/20 NP Florent et al [64] 2006 P, Scr> 15 ans: 167 avec HSCT ou HM 1 PCR-ELISA NM Se mtADN 100/547/71/100 100/896/25/100 Lass-Florl et al [70] 2004 P, D Adultes: 36 avec HM ou greffe solide et infiltrats pulmonaires suspects pour aspergillose; patients recevaient une thérapie antifongique 1 PCR-ELISA NM WB 18S NP 40/100 / – / 44 Kawazu et al [72] 2004 P, Scr Adultes: 96 avec des troubles hématologiques 1 PCR en temps réel NM PL 18S ​​875 / – / – / – NP Buchheidt et al [66] 2004 P, D Adultes: 165 avec HSCT allogénique / autologue ou HM 6 PCR nichée et PCR en temps réel NM WB 18S 50/635/95/943 375/923/95/95 Sens / Spec PPV / NPV Année de référence Conception Population / Condition Nombre de centres Amplification PCR et méthode d’identification Sens d’analyse UFC / mL Échantillons Gène cible Échantillonnage en série d’échantillons uniques Hummel et coll. [71] 2010 P, D Enfants et adultes n = 91 6 PCR nichée suivi de la PCR en temps réel 1-5 pour les imbriqués, 15 pour la PCR en temps réel WB 18S 43/100/100/20 NP Florent et al [64] 2006 P, Scr> 15 ans: 167 avec HSCT ou HM 1 PCR-ELISA NM Se mtADN 100/547/71/100 100/896/25/100 Lass-Florl et al [70] 2004 P, D Adultes: 36 avec HM ou greffe solide et infiltrats pulmonaires suspects pour pergillose; patients recevaient un traitement antifongique 1 PCR-ELISA NM WB 18S NP 40/100 / – / 44 Kawazu et al [72] 2004 P, Scr Adultes: 96 avec des troubles hématologiques 1 PCR en temps réel NM PL 18S ​​875 / – / – / – NP Buchheidt et al. [66] 2004 P, D Adultes: 165 avec HSCT allogénique / autologue ou HM 6 PCR nichée et PCR en temps réel NM WB 18S 50/635/95/943 375/923/95/95 Vrai-positif les résultats sont définis comme des cas prouvés d’aspergillose, tandis que les résultats vrais négatifs sont définis comme l’absence de critères pour l’aspergillose invasive: CFU, unités formant des colonies; D, diagnostic; ELISA, dosage immuno-enzymatique; HM, malignité hématologique; HSCT, greffe de cellules souches hématopoïétiques; mt, mitochondrial; NM, non mentionné; NP, pas possible de calculer; NPV, valeur prédictive négative; P, prospective; PL, plasma; PCR, amplification en chaîne par polymérase; PPV, valeur prédictive positive; S, Svedberg, Scr, projection; Se, sérum; Sens, sensibilité; Spec, spécificité; WB, sang total Large Il faut des études sur l’impact économique des tests basés sur la PCR pour diagnostiquer l’IA Nous sommes convaincus que, après que ces techniques deviendront des procédures opératoires standard pour les laboratoires de diagnostic hospitaliers, elles s’avéreront rentables Par exemple, une étude évaluant un test PCR pour IA chez des receveurs neutropéniques fébriles avec des greffes de cellules souches hématopoïétiques et des patients atteints de leucémie aiguë a montré que si le traitement antifongique était basé sur un résultat PCR positif, le traitement antifongique aurait pu être réduit de 20% [63] Comparés aux dosages sérologiques du galactomannane, les dosages basés sur la PCR semblent plus sensibles et plus spécifiques pour le diagnostic d’IA [64, 73] D’intérêt, quand ces dosages sont combinés, ils peuvent améliorer la sensibilité et la VAN [ 64] La combinaison du galactomannane et des tests basés sur la PCR pourrait également aider à identifier les cas graves d’IA dans lesquels le pronostic est mauvais. La signification d’un test basé sur la PCR était e évalué dans une étude récente évaluant la mortalité à 90 jours chez des patients ayant une IA avérée ou probable avec deux tests sérologiques positifs au galactomannane La positivité PCR pour les espèces Aspergillus dans deux tests séquentiels utilisant des amorces de détection d’ADN ribosomique était liée à une augmentation significative de la mortalité. noter que l’utilisation d’amorces de détection d’ADN mitochondrial n’était pas liée à une mortalité accrue, ce qui soulève quelques questions sur la généralisation de ces résultats [74] Les tests PCR basés sur des échantillons non sangsants, comme le liquide ou le tissu broncho-alvéolaire BAL Une étude évaluant la PCR sur des échantillons de biopsie pulmonaire a inclus 15 patients avec IA éprouvée recevant divers schémas thérapeutiques antifongiques et présentant une sensibilité de 100%, contre 40% de sensibilité pour la PCR de la biopsie pulmonaire. Du sang [70] En outre, parmi 49 patients atteints d’aspergillose pulmonaire chronique, le résultat de la culture du BAL était p Ces résultats ont été confirmés dans une méta-analyse récente dans laquelle on a trouvé que la PCR du liquide de BAL avait une sensibilité très variable mais supérieure à celle de la culture. diagnostic d’IA [76] En ce qui concerne d’autres échantillons cliniques, dans une petite étude incluant 6 patients atteints d’aspergillose cérébrale, un test PCR d’échantillons de liquide céphalo-rachidien a démontré une sensibilité de 100% [77]

DIAGNOSTIC DE RÉSISTANCE ANTIFONGIQUE

L’identification des mutations ponctuelles connues pour conférer une résistance antifongique pourrait entraîner un traitement antifongique précoce et ciblé [75, 78-81] De nombreuses mutations génétiques conférant une résistance antifongique aux champignons ont été étudiées [78] Bien que les données utilisant cette stratégie pour l’IA soient limitées, des études récentes ont montré des résultats prometteurs pour la détection rapide et sensible de l’ADN d’Aspergillus dans des échantillons cliniques, tout en fournissant des résultats concernant les mutations du gène cyp51A, qui transcrit la protéine 14α-sterol-demethylase, la protéine cible des triazoles [75, 79-81] le développement de techniques identifiant des mutations ponctuelles de gènes [82, 83] pourrait fournir un diagnostic rapide et une identification rapide simultanée de la résistance antifongique. Cependant, avant l’adoption large de ces tests, les études devraient étudier la signification clinique de ces mutations de résistance. présent dans une minorité de cellules fongiques et ont une signification clinique limitée. Par exemple, dans un étude qui a évalué l’utilisation d’un test basé sur la PCR dans des échantillons de patients atteints d’aspergillose pulmonaire chronique recevant des triazoles, 4 des 4 patients porteurs de la mutation M220 dans cyp51A ont échoué un traitement antifongique, alors que seulement 6 des 14 patients avec le TR / L98H En fin de compte, la prise en charge des mycoses invasives présente un défi thérapeutique et diagnostique L’instauration précoce d’un traitement antifongique ciblé est vitale et peut maximiser l’efficacité de nouveaux agents antifongiques. Des tests PCR pourraient permettre une identification rapide et plus sensible des Comparaison avec les techniques traditionnelles Tableau 4 Cependant, les protocoles de PCR manquent de standardisation, et un futur consensus, tel que celui de l’European Aspergillus PCR Initiative [84], facilitera les grandes, prospectives , essais cliniques Les études futures devraient se concentrer sur l’intégration de ces techniques dans la prise de décision clinique. Il est également prudent d’étudier le nombre idéal de spécimens définissant une infection fongique positive. La mise en œuvre de tests PCR seuls ou en combinaison avec d’autres tests en milieu clinique améliorera probablement les résultats thérapeutiques et facilitera le suivi du traitement, tout en personnalisant la durée du traitement. thérapie

Tableau 4Evaluation des techniques moléculaires et traditionnelles pour le diagnostic des infections fongiques invasives Candida Candida et Aspergillus Aspergillus Culture sanguine caractéristique PCR dans le sang β-D-glucan Culture sanguine PCR dans le sang BAL Culture BAL PCR Galactomannana Sensibilitéb / Spécificitéb Faible coût Rapidité c d Requiert moins personnel qualifié contamination Riske – identification de la résistance antifongique -f – -f -f – Polyfungal détection de l’infection – – – Suivi de la réussite de la thérapie antifongique – – rendement diagnostique au cours du traitement antifongique Candida Candida et Aspergillus Aspergillus caractéristique hémoculture PCR en β-D sang -glucan Culture de sang PCR dans le sang BAL Culture BAL PCR Galactomannana Sensibilitéb / Specificityb Faible coût Rapidité c d nécessite un personnel moins qualifié contamination Riske – Identification de la résistance Antifongique -f – -f -f – Polyfungal détection de l’infection – – – Suivi de la réussite de la thérapie antifongique – – rendement diagnostique au cours du traitement antifongique Comparaison entre les différentes méthodes de détection fongique a été fait par la recherche de la bibliographie par tous les auteurs indépendamment, après quoi les résultats ont été comparés. Abréviations: BAL, lavage broncho-alvéolaire; PCR, amplification en chaîne par polymérase; , juste; , bien; , très bon; , excellent; -, non applicable uniquement pour le diagnostic de l’aspergillose invasivebLes résultats varient selon qu’un test est effectué une ou deux fois et si des valeurs seuils différentes sont utilisées. Identification des espèces non albicanes. Les espèces de Candida peuvent prendre encore plus de temps.Les microorganismes sporulés peuvent prendre du temps.Le risque de contamination est plus faible Avec des méthodes automatiques, les données montrent rapidement une excellente promesse dans la détermination rapide et efficace de la résistance antifongique.

Remarque

Conflits d’intérêts potentiels

EM a reçu un soutien financier d’Astellas et de T2 Biosystems pour des projets non pertinents à ce travail et a siégé au conseil consultatif d’Astellas. Tous les autres auteurs ne signalent aucun conflit potentiel Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels. au contenu du manuscrit ont été divulgués