La mélanocortine endogène

les agonistes comprennent α -, β – et γ -mélanocyte-stimulant

hormones (MSH) sont dérivées par le traitement post-traductionnel du

pro-opiomélanocortine (POMC) gène.1 Tous

Les agonistes de mélanocortine dérivés de POMC possèdent un “ His-Phe-Arg-Trp ”

domaine dans leur séquence d’acides aminés primaire. Le synthétique couramment utilisé

les analogues NDP-MSH et MT-II possèdent un noyau His-dPhe-Arg-Trp

sequence.2 − 4 La séquence de tétrapeptide conservée a été déterminée

être important pour la liaison ligand / reconnaissance moléculaire et stimulation

des récepteurs de la mélanocortine (MCR) .5,6 Les MCR sont

G récepteurs couplés aux protéines (GPCR) qui activent l’adénosine cyclique

voie de transduction du signal monophosphate (AMPc) et générer une cascade

des événements intracellulaires, qui se traduisent par des réponses physiologiques.

Cinq récepteurs de la mélanocortine (MC1 – 5R) ont été clonés et caractérisés.7 − 13 Tous les récepteurs de la mélanocortine répondent à la mélanocortine endogène

hormis le MC2R, qui ne répond qu’à l’ACTH. Donc,

le MC2R a été exclu de cette étude.8 Le récepteur de la mélanocortine-1 (MC1R) est impliqué dans la

cheveux

pigmentation.7,8 Le récepteur de la mélanocortine-5 (MC5R)

est trouvé dans une variété de tissus et identifié pour être un agent exocrine

fonction de la glande chez la souris.14 La mélanocortine-3

et -4 récepteurs (MC3R et MC4R) sont exprimés dans le cerveau et ont

été identifié pour réguler le comportement alimentaire, le métabolisme, l’énergie,

et l’homéostasie de poids.15 − 19 Administration centrale de α -MSH ou mélanocortine synthétique

agonistes tels que MT-II, entraîne une diminution de l’apport alimentaire. Ces effets

produits par des agonistes peuvent être bloqués par la préadministration de

Antagoniste du récepteur MC3 / MC4 SHU9119.15

MC4R a été largement étudié comme une cible potentielle de médicament pour l’alimentation

troubles liés à sa régulation du poids et de l’homéostasie énergétique.

L’implication du MC3R dans le métabolisme et l’homéostasie énergétique a

été suggéré par plusieurs études, mais les mécanismes sous-jacents de

les actions ne sont pas claires.17 − 19 Des ligands sélectifs et puissants sont nécessaires pour caractériser

ces récepteurs in vivo. Les agonistes peptidiques endogènes

sont puissants mais non sélectifs aux récepteurs de la mélanocortine.

ligands peptidiques et non peptidiques pour les MCR sont rapportés

dans la littérature, mais les exigences structurelles pour la conception de récepteurs

Les ligands sélectifs ne sont pas simples. Diverses approches ont

été explorée pour surmonter ce problème, y compris l’utilisation de contraintes

et des acides aminés non naturels plus volumineux, des modifications du squelette et de la cyclisation.20 − 23 L’utilisation d’acides aminés β a été utilisée avec succès dans

le passé pour le développement de ligands puissants, sélectifs et stables.24 − 26 Dans une étude, Nunn et al. a rapporté que les analogues de β -tetrapeptide

de l’hormone somatostatine se comportent comme des agonistes puissants à la somatostatine

4 récepteurs (SSTR4) .26 Plus récemment, Mollica

et al. ont montré que la biphaline peptidique opioïde avec la substitution de 3-amino-acide β aboutissait à une stabilité enzymatique accrue.25 Kulkarni et al. sélectivité des sous-types de récepteurs

quand le résidu His a été remplacé par un acide aminé β dans la mélanocortine

antagoniste SHU9119 template.27 Peptides

contenant des acides aminés β -amino ont un groupe méthylène supplémentaire dans le

épine dorsale peptidique, soit entre le carbonyle et les carboxanes

(β 3) ou entre les atomes de carbone et d’azote

(β 2) (Figure ​ (Figure11) .28 En raison de leur backbone étendu, β -amino

les peptides contenant de l’acide sont capables d’obtenir des conformations multiples.

β -Les acides aminés sont également bien connus pour induire des structures secondaires,

qui leur permettent souvent d’imiter les propriétés structurelles et fonctionnelles

de peptides natifs.29,30 De plus, β -aminoacides

dans les peptides ne sont pas facilement reconnus par les peptidases et signalés

être plus stable vis-à-vis de la dégradation protéolytique in vitro et in vivo25,31,32. Par conséquent, remplacement d’un ou plusieurs résidus d’acide aminé α

aux acides aminés β -amino peut être une option viable pour améliorer fonctionnelle

propriétés d’un peptide.24,25Figure 1Structures of α –

et β -aminoacides. Le cercle bleu

indique la position d’un groupe méthylène supplémentaire dans le peptide

backbone.Previous structure – activité

études de relation (SAR) ont

identifié le “ His-Phe-Arg-Trp ” et “ Phe-Arg-Trp ”

comme les séquences minimales nécessaires pour générer la réponse dans le

bioessais de peau de grenouille et de lézard. 2 − 4 Études de troncature subséquentes

du puissant peptide NDP-MSH (Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2) a établi que Ac-His-dPhe-Arg-Trp- NH2 activé tous les quatre mélanocortine

récepteurs (MC1 et MC3 – 5R) à des concentrations nanomolaires. Dans

comparaison, le tripeptide, Ac-dPhe-Arg-Trp-NH2, possédait des activités agonistes micromolaires au MC1R, MC4R, et

MC5R et seulement légèrement activé le MC3R lorsqu’il est testé jusqu’à 100 μ M

concentrations.6Il est supposé

cette insertion d’un acide aminé β

agoniste de mélanocortine “ His-Phe-Arg-Trp ” séquence pourrait

modifier la sélectivité et / ou la puissance aux récepteurs de la mélanocortine. Basé

Sur la base de la justification ci-dessus, cette étude a été conçue pour introduire β 3-acides aminés analogues (β 3 hPhe, β 3 hdPhe, β 3 hArg et β 3 hTrp) aux positions Phe, Arg et Trp du tétrapeptide

Ac-His-dPhe-Arg-Trp-NH2 (1). Quatre

des analogues contenant β 3 acides aminés (β 3 hXaa) ont été synthétisés et caractérisés pharmacologiquement

au niveau des mMCRs de la souris (figure ​ (figure 22 et tableau 1). Figure 2: Structures des tétrapeptides contenant des acides aminés contenant 3 acides aminés &#x003b2.

Le cercle bleu indique la position d’un groupe méthylène supplémentaire

le peptide squelette. Ces peptides ont été synthétisés par micro-ondes assistée

SPPS Fmoc

en utilisant la résine Rink Amide MBHA dans un synthétiseur manuel à micro-ondes (Discover

SPS CEM Corp.). Tous les peptides synthétisés ont été acétylés à l’extrémité N-terminale

et amidé à l’extrémité C-terminale. La purification a été réalisée par semipreparative

RP-HPLC, et la caractérisation a été faite en utilisant HPLC analytique et masse

spectrométrie (voir Informations de support). Le tableau 1 résume l’agoniste fonctionnel

pharmacologie des peptides synthétisés chez les souris MCR en utilisant le

Test AlphaScreen à base de cAMP (PerkinElmer) .Le tétrapeptide

Ac-His-dPhe-Arg-Trp-NH2 (1) a été utilisé

comme un contrôle dans cette étude et possédait nanomolaire

activité agoniste à tous les MCR avec ∼

mMC4R, en accord avec des études antérieures.6 Le peptide de noyau d’agoniste de mélanocortine Ac-His-Phe-Arg-Trp-NH2 (2), possédait 130, 25, 200, et 18 fois

puissance réduite par rapport à 1 au mMC1R et mMC3 – 5Rs,

respectivement. Le tripeptide Ac-dPhe-Arg-Trp-NH2 (3) possédait 550 fois moins d’activité au mMC1R

par rapport à 1 et était seulement capable de stimuler le mMC3R,

mMC4R, et mMC5R à 40%, 70% et 70% de la réponse maximale de l’AMPc,

respectivement, à 100 μ M concentrations. Tripeptide Ac-Phe-Arg-Trp-NH2 (4) a entraîné une perte d’activité stimulatrice

au mMC3 & 5Rs et a montré une légère activité agoniste au mMC1R

à 100 μ M concentrations. Les données rapportées ici pour le endogène

peptide α -MSH tétrapeptides 1 et 2 sont en accord avec les valeurs rapportées dans la littérature, en utilisant

un cAMP β -galactosidase rapporteur gène test.6Table 1Agonist Potency (nM) pharmacologie

des Tetrapeptides aux Récepteurs de Melanocortine de Souris en utilisant le

AlphaScreen cAMP (Perkin Elmer) Les peptides β 3 hPhe (5) et β 3 hdPhe (6) ont été les moins tolérés

substitutions aux MCR. Comparé à 1, le tétrapeptide

Ac-His – β 3 hPhe-Arg-Trp-NH2 (5) a entraîné une diminution de l’activité de 365, 1280 et 1200 fois

mMC1R, mMC4R et mMC5R, respectivement, et ont montré seulement 70% maximum

réponse AMPc au mMC3R à 100 μ M concentrations (Figure ​ (Figure3) .3). Le peptide 6 a donné un 7 μ M

agoniste complet à la mMC1R mais était seulement capable de stimuler le mMC3R,

mMC4R, et mMC5R à 50 – 60% de réponse maximale de l’AMPc à 100 μ M

concentrations (Figure ​ (Figure3) .3). Substitution de

le résidu Arg avec β 3 hArg et le remplacement Trp

par β 3 hTrp dans le tétrapeptide de référence résultant

dans les peptides 7 et 8, respectivement. Les peptides 7 et 8 ont montré des activités agonistes complètes allant

de nanomolaire à des puissances micromolaires à la souris MC1R et MC3 – 5Rs.

Le peptide Ac-His-dPhe – β 3 hArg-Trp-NH2 (7) possédait une puissance diminuée de 22, 12 et 18 fois

à la mMC3R, mMC4R, et mMC5R, respectivement, et a montré l’équipotence

à la mMC1R par rapport à 1. Peptide (7)

était 12 fois plus sélectif sur le mMC4R par rapport au mMC3R. Le tétrapeptide

Ac-His-dPhe-Arg – β 3 hTrp-NH2 (8) était le composé le plus puissant de la série montrant l’équipotent

activités comparées au peptide de référence 1 au mMC1R,

mMC4R et mMC5R, et a entraîné une diminution de 11 fois la puissance mMC3R.

Le peptide (8) est sélectif de 35 fois envers le mMC4R contre

le mMC3R, mais n’a montré aucune sélectivité par rapport à la mMC1R et la

mMC5R (Tableau 1). Figure 3 Illustration de l’agoniste pharmacologique

dose – réponse

courbes pour les tétrapeptides signalés. Le MC3R et le MC4R sont

impliqué dans la régulation de la nourriture et de l’énergie

l’homéostasie, mais le mécanisme sous-jacent de leur chevauchement / synergique

les rôles ne sont pas clairement compris. Par conséquent, la découverte de puissants et

des ligands sélectifs pour ces récepteurs sont hautement souhaitables. Le stratégique

remplacement des résidus clés de mélanocotine par les acides aminés 3 β 3 dans la région pharmacophore du tétrapeptide

conduit à des composés puissants et sélectifs dans cette étude. Peptide 5 (β 3 hPhe à la place de dPhe) maintenu

activité agoniste complète à la mMC1R, mMC4R, et mMC5R, mais avec

diminué les puissances par rapport à 1, et avait un agoniste léger

activité au mMC3R. Le peptide 6 a donné 220 fois

diminution de la puissance au mMC1R et n’a montré qu’une faible activité agoniste

à mMC3R, mMC4R et mMC5Rs, par rapport à (1). Celles-ci

les résultats soutiennent l’hypothèse concernant la chaîne latérale des acides aminés Phe

comme un résidu clé dans la séquence de tétrapeptide de mélanocortine de base et

suggère que l’introduction d’un groupe méthylène supplémentaire entre

les résidus Phe et Arg perturbent grandement les interactions clés putatives

d’un groupe phényle aromatique et / ou d’un résidu d’arginine voisin avec

les MCRs.Peptides 7 et 8 ont montré

puissances nanomolaires

et sélectivité de 12 et 35 fois pour le mMC4R sur le mMC3R, respectivement.

Il convient de mentionner que le peptide 8 a montré une augmentation

sélectivité pour le mMC4R sur le mMC3R, tout en conservant le nanomolaire

activité fonctionnelle équipotente par rapport à 1. La

sélectivité améliorée du tétrapeptide 8 pour mMC4R

peut être postulé à la conformation bioactive préférée du sous-type récepteur

du peptide en raison du placement de h β 3-amino

l’acide dans la séquence tétrapeptidique. Le groupe méthylène supplémentaire

près du résidu Trp dans le peptide 8 peut modifier l’épine dorsale

angles dièdres (phi et psi) et l’orientation de la chaîne latérale indole

en comparaison avec le peptide 1. La chaîne latérale de Trp est

unique, avec son caractère amphipathique lui permettant de participer à

Dans une étude récente, la participation du résidu Trp dans

stabilisation de la conformation bioactive aux récepteurs de la mélanocortine a été

rapporté.22 Etudes biophysiques suggérées

que le résidu Trp interagissait avec le résidu His pour stabiliser

le virage inverse dans la région pharmacophore, ce qui a entraîné une

Ligand mMC4R sélectif 50 fois sur le mMC3R. Le manque de sélectivité

du composé 8 pour le mMC4R par rapport au mMC1R et

le mMC5R peut suggérer des préférences de conformation ligand similaires

par ces récepteurs contrairement au mMC3R. Résultats de l’étude actuelle

indique que la position Trp dans la séquence de base putative de mélanocortine

les agonistes peuvent être exploités pour différencier la pharmacologie au mMC3R

et mMC4R. D’autres études SAR sont nécessaires pour tester cette hypothèse. En résumé, quatre hybrides α / β 3 tétrapeptides

ont été synthétisés en incorporant β 3-aminoacides

dans la séquence centrale de l’agoniste de la mélanocortine. Deux composés ont résulté, 7 et 8, avec des puissances agonistes nanomolaires et

sélectivité améliorée au mMC4R par rapport au mMC3R. Ces résultats

fournir des informations sur les conséquences de l’incorporation de β 3-résidus d’acides aminés dans la séquence de message putative de

agonistes de la mélanocortine. Le peptide le plus puissant Ac-His-dPhe-Arg – 3 hTrp-NH2 (8) dans cette étude possédait une puissance de 12 nM et une sélectivité de 35 fois à

le mMC4R sur le mMC3R. Le modèle présenté ici peut servir

comme échafaudage pour la conception des ligands MCR puissants et sélectifs goutte.