Le récepteur de chimiokine CXCR4 est un membre proéminent de la famille des récepteurs couplés à la protéine G (GPCR) de type rhodopsine. C’est aussi le premier GPCR peptidergique dont la structure a été déterminée par cristallographie aux rayons X. CXCR4 reconnaît et est activé par la chimiokine SDF-1, également appelée CXCL12. CXCR4 est une cible importante pour le développement de ligands synthétiques, et de nombreux ligands peptidiques et non peptidiques ont été développés. Cependant, pour CXCR4, tous ces ligands sont des antagonistes, ou des agonistes inverses, comme le cyclopeptide T140 et ses analogues.9 T140 est un agoniste inverse puissant du CXCR4 dérivé du peptide polyphémusine du fer à cheval. Outre les fragments peptidiques N-terminaux de SDF-1 α ayant de faibles affinités10 ou des versions recadrées de SDF-1 &#x003b1 ;, 11,12 aucun agoniste synthétique de haute affinité n’est disponible. L’axe CXCR4 / SDF-1 est un acteur principal dans la recherche de cellules souches hématopoïétiques (CSH) sur la moelle osseuse13 et aussi Dans les deux cas, le SDF-1 fournit des indications directionnelles pour la migration des cellules motiles dans la niche de la moelle osseuse, ainsi que pour leur rétention à cet endroit. Par conséquent, le blocage de l’axe CXCR4 / SDF-1 par les antagonistes synthétiques du CXCR4 est devenu une stratégie majeure pour prévenir la dissémination métastatique.15 Cependant, un inconvénient de l’utilisation à long terme des antagonistes CXCR4 est déjà apparu dans l’essai clinique initial évaluant les antirétroviraux. l’activité de l’AMD3100 (un antagoniste de la petite molécule CXCR4) est l’élimination des CSH de leurs niches de moelle osseuse.16 En conséquence, l’inhibition à court terme CXCR4 / SDF-1 est maintenant utilisée pour la mobilisation des CSH à la périphérie pour un accès plus facile aux greffes de HSC.Enfin, la mobilisation de cellules cancéreuses métastasées à partir de niches de moelle osseuse pendant la chimiothérapie est censée retirer ces cellules de leur microenvironnement protecteur, une approche actuellement sous évaluation clinique.18Des données récentes suggèrent que l’application systémique d’agonistes CXCR4 plutôt que d’antagonistes pourrait représenter un Contrairement à l’argument selon lequel l’agonisme de CXCR4 est bénéfique dans le contexte du cancer, il a été démontré que les cellules cancéreuses réduisent l’expression de SDF-1 et la ré-expression forcée de la dissémination de métastases réduite par SDF-1. 20,21 La base mécanique de ceci pourrait être soit le flou des gradients SDF-1 requis pour fournir des informations directionnelles ou induire CXCR4 downregulation de la surface cellulaire par l’internalisation des récepteurs.11 Ici, nous avons entrepris de concevoir de puissants agonistes synthétiques CXCR4. Notre stratégie était basée sur des expériences de photomarquage avec des photoanalogues T140 et sur des études de silico-docking.22 Ces travaux ont montré plusieurs modes de liaison possibles, dans lesquels les chaînes latérales des résidus 12 et 14 de T140 étaient dirigées vers le faisceau transmembranaire de CXCR4. Nous avons donc émis l’hypothèse que la greffe de peptides agonistes CXCR4 de faible affinité dérivée de la séquence N-terminale de SDF-1 sur l’échafaudage de haute affinité T140 conférerait des propriétés agonistes aux molécules chimères combinées de haute affinité. Nous montrons ici qu’en fonction des résidus T140 choisis pour greffer les peptides N-terminaux SDF-1, les peptides résultants étaient en effet très puissants agonistes CXCR4 qui induisent efficacement chimiotaxie CXCR4-dépendante. Deux séries de T140-SDF-1 α les chimères ont été synthétisées (tableau 1). La première série a la partie N-terminale de SDF-1 α (longueur de chaîne 7 ou 8 résidus) couplée à la position 12 de T140 (T140 (Lys12 – ε [SDF (1 – 7)]) (1) et T140 (Lys12 – ε [SDF (1 – 8)]) (2)). La deuxième série a le N-terminal de SDF-1 α (longueur de chaîne 6 – 10 résidus) couplée à la position 14 de T140 (T140 (Lys14 – ε [SDF (1 – 6)]) (3), T140 (Lys14 – ε (1 – 7)]) (4), T140 (Lys14 – ε [SDF (1 – 8)]) (5) et T140 (Lys14 – ε [SDF (1 – 8, Ser9)] (6) Le résidu accepteur de couplage en position 12 (Cit) ou 14 (Arg) a été remplacé par une lysine Une série similaire portant le peptide peptide en position 14, mais avec un supplément de citrulline en arginine une substitution sur la position 12 pour compenser la perte de charge provoquée par la modification sur la position 14, a également été synthétisée (T140 (Arg12, Lys14 – ε [SDF (1 – 6)]) (7), T140 (Arg12, Lys14 – ε [SDF (1 – 7)]) (8), T140 (Arg12, Lys14 – ε [SDF (1 – 8)]) (9), T140 (Arg12, Lys14 – ε [SDF (1 – 8, Ser9)] (10), T140 (Arg12, Lys14 – ε [SDF (1 – 8, Ser9, Pro10)] ( 11), et T140 (Arg12, Lys14 – ε [SDF (1 – 8, Ser9, Ala10)] (12).) Pour tous les composés avec une chaîne latérale SDF-1 &#x003b1 allant de m 9 à 10 acides aminés (6 et 10 𝲝 12), la cystéine sur la position 9 de SDF-1 α a été substitué par un acide aminé isostérique, sérine. Enfin, une variation de 11 a été synthétisée avec une alanine remplaçant la proline en position 10 de SDF-1 (12) pour ajouter de la flexibilité au peptide. Table 1Séquences et Affinités de T140-SDF-1 α Chimeras exprimée en IC50 pour déterminer l’affinité du T140-SDF-1 α chimères, nous avons effectué des dosages de liaison par compétition de radioligand en utilisant 125I-SDF-1 α en tant que traceur sur des cellules HEK293 exprimant de manière stable CXCR4 humain. Liaison homologue en utilisant SDF-1 α a été évaluée en utilisant un modèle de liaison à un site et présentait une affinité de 0,08 ± 0,07 nM, ce qui correspond au site de haute affinité de SDF-1 α 23 (Figure ​ (Figure1) .1). Les composés 1 et 2, tous deux avec le SDF-1 α chaîne située sur la position 12 de T140, a montré des affinités de 1.36 ± 0,8 et 2,22 ± 1,75 nM, respectivement. Figure 1 Essai de liaison de compétition avec 125I-SDF-1 α des analogues 7 et 10 contenant des SDF-1 &#x003b1 variables; des longueurs de chaîne sur des cellules HEK293 exprimant de manière stable CXCR4 humain ont été réalisées comme décrit dans les Procédures Expérimentales. Les valeurs IC50 ont été déterminées … Nous avons ensuite évalué les chimères avec leur SDF-1 α chaîne en position 14 et citrulline en position 12 (comme en T140). Les affinités pour ces composés commençant par le plus court SDF-1 α la chaîne latérale était 62.02 ± 12.18 (3), 170.0 et # x000b1; 57,41 nM (4), 21,67 ± 7,2 nM (5) et 21,23 ± 4,00 nM (6) pour la plus longue dérivée. Pour la deuxième série de chimères avec le SDF-1 α chaîne en position 14 et la citruline supplémentaire en substitution de l’arginine en position 12, composé 7, avec le plus court SDF-1 α chaîne latérale de la série, a montré une affinité de 28,33 ± 10,9 nM. Les composés 8 et 9 présentaient des affinités de 38,61 ± 10.01 et 16.51 ± 4,08 nM, respectivement.Ainsi, l’arginine sur la position 12 semble fournir une affinité supérieure à la citrulline: par exemple, 10 (avec Arg12) (5,67 ± 0,24 nM) contre 5 (avec Cit12) (21,23 ± 4,00 nM). L’analogue 11, avec le peptide SDF-1 le plus long de cette série, présentait une affinité de 9,57 ± 4,76 nM, donc une augmentation de près de 3 fois par rapport à 12, à 24,92 ± 5,20 nM. L’analogue 12 est identique à 11 à l’exception d’une substitution Pro à Ala à la position 10 du peptide SDF-1 greffé. Cette modification de la séquence N-terminale SDF-1 d’origine, en plus d’un commutateur Cys à Ser nécessaire en position 9, semble être responsable de la perte d’affinité observée. La restauration du profil de charge de T140 en introduisant Arg sur la position 12 au lieu de la citrulline isostérique pour compenser la perte d’une charge positive en position 14 (Lys acylé au lieu de Arg) semble fournir une interaction favorable avec CXCR4. La longueur du peptide greffé semble également avoir une influence sur l’affinité, avec 10 10 acides aminés optimaux. Pour évaluer les caractéristiques fonctionnelles des composés, des tests de chimiotaxie ont été réalisés en utilisant des cellules REH. Comme prévu, SDF-1 α migration induite suite à une réponse en forme de cloche classique à partir de 0,01 nM, avec un pic à 1 nM suivi d’une diminution rapide à des concentrations plus élevées de chimiokines (Figure 2) .2). Les composés 1 et 2 n’ont induit aucune migration de cellules REH mais ont agi comme des antagonistes vis-à-vis de la chimiotaxie induite par SDF-1 (Informations de support, Figure S1). En outre, certains des T140-SDF-1 α les chimères avec la chaîne latérale sur le résidu 14 de T140, 3, 6, 7 et 9 n’ont pas induit d’activité chimiotactique significative par rapport au témoin (milieu de migration uniquement). Le peptide 5, avec la citrulline conservée en position 12 de T140, semble être un agoniste de faible puissance avec un pic à 100 nM. Les composés 8 et 10 ont agi comme des agonistes avec une efficacité réduite, induisant une migration plus faible que SDF-1 & spplus, avec des pics à 10 nM, seulement un log au-dessus de l’agoniste naturel des chimiokines SDF-1. Le composé 11 est un agoniste à faible efficacité avec une migration maximale induite à 10   100 nM. Les composés 12 et 4 ont montré une efficacité similaire à celle du SDF-1, avec des pics à 10 nM et 1 M, respectivement, l’analogue 4 ayant ainsi une activité très faible. Alors que le composé avec une proline, 11, présentait une meilleure affinité, l’échange proline-alanine en position 10 (composé 12) de la chaîne, conçu pour fournir une flexibilité supplémentaire au peptide greffé, semblait donc améliorer l’efficacité en chimiotaxie. Il n’y a pas de corrélation entre l’efficacité et l’affinité des composés 4 et 5: composés 4, 6 et 10 et 12: essai de migration Transwell où la chimiotaxie est exprimée en% de cellules REH initialement ensemencées sur la plaque Neuroprobe ChemoTx a migré vers la chambre du bas. Les expériences ont été réalisées en triple, comme décrit … Nous avons synthétisé avec succès des agonistes de CXCR4 en combinant un échafaudage agoniste inverse (T140) avec le peptide N-terminal de SDF-1, un agoniste de faible affinité. Deux séries analogues, avec ce peptide N-terminal de SDF-1 greffé en tant que chaîne latérale à deux positions de T140, à savoir les positions 12 et 14, ont été préparées avec une greffe peptidique de longueur de chaîne variable. Les propriétés pharmacologiques de ces séries d’analogues ont ensuite été évaluées. À partir de la relation d’affinité de la structure – il apparaît que le positionnement de la chaîne N-terminale de SDF-1 α sur le douzième acide aminé de T140 conserve une haute affinité pour CXCR4, mais les chimères résultantes restent des antagonistes. Cependant, la fixation de SDF-1 α Les peptides N-terminaux de la chaîne latérale de la position 14 de T140 semblaient conférer des propriétés agonistes aux analogues. Une efficacité chimiotactique complète et des affinités améliorées ont été obtenues en utilisant la position 14 de T140 pour le greffon peptidique et en substituant simultanément Cit à Arg en position 12 de la matrice T140. L’analogue 4, avec une greffe peptidique de 7 résidus, est un agoniste complet de la chimiotaxie, mais en raison de sa faible affinité (IC50 = 170,0 nM), il n’est pas très puissant (pic à 1 μ M). L’analogue 12, avec une greffe peptidique de 10 résidus, est également un agoniste complet avec une puissance bien supérieure (pic de chimiotaxie à 10 nM). L’échange Pro-Ala en position 10 du SDF-1 &#x003b1 greffé; le peptide dans le composé 12 a abaissé l’affinité mais a induit des propriétés agonistes complètes par rapport à son homologue 11 avec le SDF-1 &#x003b1 natif; (Ser9) 1 – 10 séquence, suggérant une plus grande flexibilité des peptides étant nécessaire pour une meilleure efficacité. La structure future et les études de fonction seront nécessaires pour clarifier ceci et améliorer davantage ces agonistes chimériques de chimiokine. Un modèle rationalisant les différents résultats obtenus en fonction de la position de l’accepteur de greffe de T140 sur le CXCR4 est présenté à la figure S2 dans l’information de support. En conclusion, nous avons synthétisé deux agonistes complets de CXCR4 avec des puissances chimiotactiques. ligand CXCR4 endogène, SDF-1.Nous avons également créé plusieurs agonistes partiels. Notre travail était basé sur les prémisses que l’agoniste inverse cyclopeptide T140 fournira une affinité de liaison, tandis que la chaîne N-terminale greffée fournira des propriétés agonistes, en ligne avec le modèle à deux sites suggéré pour l’interaction SDF-1-CXCR4.24 Ces composés sont des principes actifs prometteurs pour la conception future des agonistes de CXCR4.