L’uréase (EC 3.5.1.5; urée amidohydrolase) est une enzyme contenant des métaux Cette substance catalyse l’hydrolyse de l’urée en ammoniac et en dioxyde de carbone1. Elle est présente dans une grande variété d’organismes, y compris les plantes, les algues, les champignons et les bactéries.2 − 4 Les bactéries productrices d’uréase ont un effet négatif sur la santé humaine. Ils sont directement impliqués dans les infections des voies urinaires.5 L’uréase est connue pour être une cause majeure des pathologies induites par Helicobacter pylori, car elle permet aux bactéries de survivre au faible pH de l’estomac durant la colonisation, ce qui conduit à des ulcères gastriques et peptiques. Dans l’agriculture, une forte activité de l’uréase provoque des problèmes environnementaux et économiques importants en libérant des quantités anormalement élevées d’ammoniac dans l’atmosphère pendant la fertilisation à l’urée3,5,7. Outre l’importance de l’uréase pour rendre l’azote disponible aux plantes et à l’impact des ureases microbiennes en agriculture et en médecine, la structure et le mécanisme catalytique de cette enzyme sont d’intérêt académique, en raison de son fort accroissement (1014 fois) du taux d’hydrolyse de l’urée et de la présence de nickel actif, La structure, le nombre et le type de sous-unités, le poids moléculaire et la séquence d’acides aminés de l’uréase dépendent de son origine. L’uréase du haricot (Canavalia ensiformis) est une molécule homohexamérique (α 6), alors que les ureases bactériennes sont hétéropolymériques et contiennent trois sous-unités, &#x003b1 ;, &#x003b2 ;, &#x003b3 ;. Malgré la différence de structure moléculaire, les séquences d’acides aminés du site actif sont largement similaires dans toutes les urées connues, avec le même mécanisme catalytique. Les sites actifs sont toujours situés dans α Les études sur de nouveaux inhibiteurs d’uréase sont essentielles pour le développement éventuel d’une thérapie hautement nécessaire pour l’uréase. Les sous-unités contiennent le centre binucléaire du nickel, dans lequel les distances Ni et Ni sont comprises entre 3,5 et 3,7 Å .9,10. Infections bactériennes médiatisées.2,3,5,6Durant les dix dernières années, le dépistage virtuel à haut débit (HTVS) est apparu comme une alternative intéressante et intéressante au dépistage à haut débit (HTS). Le protocole de dépistage virtuel basé sur la structure (SBVS) peut être construit de plusieurs façons. Deux conditions, cependant, sont essentielles pour les SBVS: une structure cible et une base de données de ligands. Dans notre cas, la structure cible était l’uréase de Bacillus pasteurii (BP), en complexe avec l’acide acétohydroxamique (PDB code 4UBP), 11 qui a été récupéré à partir de la Banque de Données sur les Protéines. L’état actuel des inhibiteurs d’uréase est assez limité. Tous les inhibiteurs d’uréase disponibles ne sont pas d’une importance satisfaisante pour la cavité de liaison et ne sont donc pas capables d’interagir de manière optimale avec les résidus d’acides aminés cruciaux et les ions métalliques présents dans le site actif d’uréase. Par conséquent, une recherche d’inhibiteurs d’uréase nouveaux et plus efficaces pour diversifier les inhibiteurs d’uréase actuels est essentielle. Récemment, nous avons développé une banque interne de plus de 6000 composés d’origines synthétiques ou naturelles. Ces composés structurellement caractérisés remplissent les critères druglike, selon la règle de cinq de Lipinski, à l’exception de quelques composés naturels. Les composés ont été préparés pour l’accostage en deux étapes. Tout d’abord, le “ lavage ” Le module d’environnement d’exploitation moléculaire (MOE) 12 a été appliqué pour générer des états de protonation physiologiquement pertinents de composés. Deuxièmement, les coordonnées tridimensionnelles (3D) ont été générées par Concord mis en œuvre dans Sybyl 7.3.13Computational docking méthodes GOLD14 et MOE-Dock12 ont été mis en œuvre. La structure protéique a été préparée par délétion de molécules d’eau, protonation 3D et minimisation d’énergie en utilisant le MEO.La minimisation d’énergie a été réalisée en implémentant le champ de force MMFF94x et le potentiel diélectrique dépendant de la distance avec le gradient efficace de 0,05. Pendant les minimisations, tous les atomes lourds dans la protéine ont été maintenus fixes. Les calculs d’Histidine ont été considérés comme neutres selon Musiani et al.15 Les calculs de Docking ont été effectués en utilisant des paramètres par défaut (sauf mention explicite) avec les scores GOLD et London dG scores comme fonctions de notation pour GOLD et MOE-Dock, respectivement. Dans les deux cas, une région de site actif était définie par une sphère de rayon 10 Å autour du ligand dans la structure complexe de l’uréase BP.Tout d’abord, les structures de 6000 composés internes ont été analysés pour vérifier la redondance. Par conséquent, les composés répétés ont été retirés de la base de données. Ensuite, il a été garanti que chaque classe de composés était représentée au moins une fois. Pour tester l’efficacité du protocole d’accostage appliqué, trois inhibiteurs d’uréase (à savoir, la biscoumarine, l’imidazole et les dérivés de l’acide hydroxamique) ont été inclus dans un ensemble de 3000 composés choisis au hasard (groupe témoin) comme témoins positifs. . Deux sorties d’amarrage séparées ont été effectuées, l’une avec MOE-Dock et l’autre avec le programme d’amarrage GOLD. Il y a trois fonctions de notation possibles dans MOE-Dock, alors qu’il y en a deux avec GOLD. En plus des fonctions de notation, il y avait plusieurs autres paramètres qui devaient être définis pour atteindre les poses et les classements de liaison appropriés. Par exemple, nous avons vu que sur quelques méthodes de placement disponibles dans MOE-Dock, seul Triangle Matcher était assez satisfaisant pour reproduire le mode de liaison de l’un des inhibiteurs connus (acide acétohydroxamique), qui a été récupéré à partir PDB ID 4UBP.Similarly, Chaque fonction de notation, mise en œuvre dans les programmes d’amarrage, a été évaluée pour observer la possibilité de placer la bonne pose d’amarrage dans les meilleurs classements. La fonction de score dG de Londres mise en œuvre dans MOE-Dock a permis d’identifier les trois inhibiteurs connus dans les 1% supérieurs de l’ensemble du leurre testé. Avec l’ancrage GOLD, une fonction de fitness a été trouvée pour produire des enrichissements similaires à Londres dG dans MOE-Dock. Après avoir établi le protocole d’amarrage et de notation, une expérience SBVS a été mise en place pour l’uréase. Chaque molécule de la base de données a été ancrée et les 10 premières conformations de chaque composé ont été conservées pour une analyse ultérieure. Dans la première stratégie de filtrage postdocking, 200 composés les mieux classés ont été sélectionnés par les fonctions de notation GOLD et MOE-Dock. Il y avait peu de composés identiques classés à l’identique dans la liste des 200 premiers par les deux fonctions de notation. Pour filtrer davantage, un autre critère de sélection a été appliqué. Une inspection visuelle de tous les composés sélectionnés a été effectuée pour filtrer des composés similaires, améliorant ainsi la diversité dans les composés sélectionnés. Nous avons également analysé l’orientation amarrée de chaque composé sélectionné à l’intérieur du site de liaison de l’enzyme uréase BP. L’analyse de conformation ancrée a aidé à sélectionner seulement les composés qui étaient capables de représenter les interactions clés avec deux ions de nickel et en plus avec les résidus de sites actifs cruciaux.15,16 Spécifiquement, coordination avec les ions nickel et la liaison hydrogène avec His323, His324, Arg339, Gly280, Cys322, Ala366 et Ala170 ont été considérés. En outre, une attention particulière a été accordée au fait que les composés présentaient une certaine amélioration de la puissance en ce qui concerne l’inhibition de l’uréase lors de la possession d’un petit groupe hydrophobe. C’est à cause de cela que le site actif de l’uréase est situé à l’intérieur de la cavité ou de la crevasse dans le territoire interne et est entouré de résidus d’acides aminés hydrophobes de l’enzyme uréase. Le caractère hydrophobe des composés peut jouer un rôle dans le processus de marche aléatoire des composés vers le site actif et dans la liaison hydrophobe, près du site actif de l’uréase.17 Après l’application des critères de sélection susmentionnés, 14 composés structurellement distincts ont été présélectionnés et soumis pour le criblage in vitro contre l’inhibition de l’uréase par le test d’uréase in vitro basé sur un mécanisme standard. Dans cet essai, on a incubé des mélanges réactionnels constitués de 25 ml de solution d’enzyme (uricase de Jack) et 55 ml de tampon contenant de l’urée 100 mM avec 5 ml de composés à tester (0,5 mM). concentration) à 30 ° C pendant 15 min dans des plaques à 96 puits. L’activité de l’uréase a été déterminée en mesurant la production d’ammoniac en utilisant la méthode de l’indophénol décrite par Weatherburn.18 Les inhibitions en pourcentage ont été calculées à partir de la formule 100 − (ODtestwell / ODcontrol) × 100. La thiourée était utilisée comme inhibiteur standard de l’uréase. Les résultats sont reportés dans le tableau 1. Tableau 1 ID de hit initial avec leurs scores respectifs (c.-à-d., Gold Fitness Scores et London dG Scores) et leurs activités inhibitrices contre l’enzyme uréase Tous les 14 composés touchés (Tableau S1 dans les Informations de Support) ont été testés expérimentalement contre l’uréase en utilisant un test standard d’inhibition de l’uréase. Cinq composés parmi 14 hits ont montré des activités inhibitrices de l’uréase avec des valeurs IC50 comprises entre 34.10 ± 1,24 et 238,16 ± 2,04 μ M, comme indiqué dans le Tableau 1. Les activités observées pour les composés AAB429,19 AAB539,20 AAD355,218d et 14i étaient de 110,0 ± 3,06, 238,16 et # x000b1; 2,04, 31,2 ± 0,47, 34,10 ± 1,24 et 150,23 ± 5,65 μ M, respectivement. Du mode de liaison du composé AAB429, il a été observé que l’oxygène hydroxyle sur le cycle purine de ce composé se coordonne avec les deux ions nickel, comme l’oxygène hydroxyle dans l’acide acétohydroxamique. De même, l’un des atomes d’azote dans le cycle purine se coordonne avec l’un des ions nickel, ce qui rappelle les oxygènes carbonyle dans l’acide acétohydroxamique (figure S1a dans l’information de support). Ce composé mimait le mode de liaison de l’acide acétohydroxamique. En outre, il y a trois liaisons hydrogène formées entre le composé AAB429 et les résidus importants du site actif, à savoir Asp224, His323 et Cys322.Juste comme le composé AAB429, la conformation ancrée du composé AAD355 (figure S1b dans les informations de support) coordonne également avec l’atome de Ni et forme quatre liaisons hydrogène avec d’importants résidus de sites actifs. La liaison hydrogène a été observée entre les oxygènes hydroxyle et carbonyle des composés et les résidus du site de liaison Arg339, His323, Kcx220 (lysine modifiée) et Ala170. Les deux composés ont des caractéristiques distinctes dans le substituant du cycle près des atomes de Ni. Ces fonctionnalités sont responsables de la différence dans l’activité. Par exemple, avec le composé AAD355, le cycle aromatique a trois substituants hydroxyle; l’un interagit avec l’atome de Ni, tandis que les deux autres forment des liaisons hydrogène avec les Ala170 et Arg339. Cette stabilité supplémentaire due à une liaison hydrogène supplémentaire joue un rôle significatif dans l’augmentation de la bioactivité du composé AAD355. En effet, la liaison hydrogène supplémentaire dans AAD355 rend l’interaction de ce composé avec l’atome de Ni crucial plus favorablement que l’AAB429. Dans le mode de liaison du composé AAB539, l’interaction cationique arène entre le cycle phényle et l’un des nickel les atomes ont été observés. La liaison hydrogène entre l’oxygène carbonyle et le résidu de site de liaison Arg339 a été observée. Ces interactions faibles avec la poche de liaison de l’uréase pourraient être l’une des raisons de la moindre activité manifestée par ce composé par rapport à ses homologues, à savoir AAB429 et AAD355 (Figure S1c dans les Informations de Support) .De la conformation d’accostage du composé 8d (Figure ​ (figure 1), 1), il a été observé que la fraction soufre du cycle triazole du composé se coordonne avec les deux atomes de nickel dans le site actif. De même, dans le composé 14i, l’oxygène du carbonyle se coordonne avec les atomes de nickel, les pontant ainsi que la médiation de quelques liaisons hydrogène avec les résidus du site actif. De manière inattendue, ce composé a montré moins d’activité. Bien que la raison reste incertaine, cependant, une explication possible de cette différence est l’exigence du groupe carboxylate à la position où il interagit avec l’ion Ni et le composé 14i n’a pas cette caractéristique (Figure S3 à l’appui). Composé 8d (magenta) avec les ions de nickel et les résidus clés de l’uréase BP.compdRR ′ 8a2- (Br) C6H4-CH24- (CH3) C6H48b2- (Br) C6H4-CH24- (OCH3) C6H48c4- (Br) C6H4 -CH24- (CH3) C6H48d4- (Br) C6H4-CH24- (OCH3) C6H48e3- (Br) C6H4-CH24- (Br) C6H4-CH28f3- (Br) C6H4-CH24- (CH3) C6H48g2- (Br) C6H4 -CH23- (OCH3) C6H48h3- (Br) C6H4-CH23- (OCH3) C6H48i4- (Br) C6H4-CH23- (OCH3) C6H48j3,4- (OCH3) 2C6H34- (CH3) C6H48k2,4- (Cl) 2C6H3 -CH24- (OCH3) C6H481.2- (Cl) 2C6H3-CH24- (CH3) C6H48m3- (OH) -4- (OCH3) C6H34- (CH3) C6H48n2,4- (Cl) 2C6H3-CH23- (OCH3) C6H4Trois composés (c.-à-d. AAB429, AAB539 et AAD355) sur cinq coups étaient d’origine commerciale. Nous n’avons pas été en mesure de les étudier plus en détail en raison de l’inaccessibilité au moment de la présente étude. Nous sommes en train de les acquérir auprès de sources commerciales. Les deux composés restants (c.-à-d. 8d et 14i) faisaient partie des composés synthétisés à l’interne et ont donc été étudiés davantage.22,23Pour optimiser les interactions ligand avec le site de liaison, nous avons décidé de synthétiser différents dérivés des composés 8d et 14i . Pour le composé 8d, 13 analogues (série A) ont été synthétisés, alors que pour le second hit 14i, 21 dérivés différents (série B) ont été synthétisés (Tableau S2 dans Supporting Information). Le schéma 1 présente la synthèse générale des composés de la série A, tandis que les schémas 2 et 3 décrivent la synthèse de composés inclus dans la série B. La procédure détaillée de synthèse dans les schémas 1 et 3 peut être trouvée dans les informations de support.Schéma 1 Synthèse de 2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazole-3-thione 4,5-disubstituée 8a − nSchème 2Synthèse de 3- (halobenzyl) isocoumarines 13a − i, leurs céto-acides respectifs 14a − i, et 3,4-Dihydroisocoumarines 16a − iScheme 3Synthèse de 3- (Halobenzyl) -1-thioisocoumarines 17a − iAll composés synthétiques ont ensuite été soumis à un dépistage biologique contre l’inhibition de l’uréase par l’essai d’uréase standard18 ( Tableau S2 dans Informations complémentaires). Pour analyser les modes de liaison, nous avons utilisé les programmes GOLD et MOE-Dock, et pour calculer les énergies de liaison, nous avons utilisé la méthode AutoDock, célèbre pour ses prédictions de qualité des calculs d’énergie de liaison.Les composés des séries A et B ont montré des résultats biologiques intéressants . Comme prévu, les composés de la série A sont plus actifs que la série B. Dans le cas de la série A, la plupart des analogues se coordonnent avec les ions nickel par un groupement thiol du triazole et forment des liaisons hydrogène avec d’importants résidus du site actif. Dans la série B, le groupe carboxylate de céto-acides se coordonne avec l’un des ions nickel, tandis que dans les isocoumarines, l’interaction arène-cation entre le noyau phényle et l’ion nickel est observée. D’autres fractions dans ces composés ont montré une liaison hydrogène avec des résidus de sites actifs cruciaux. Des résultats d’amarrage, les poses d’amarrage similaires ont été observées pour les dérivés synthétisés. L’analyse d’ancrage a identifié le groupe thiol essentiel de la série A, à la position d’interaction avec l’ion Ni, comme un facteur clé de l’activité, car il imite le rôle du groupe hydroxyle, présent dans l’un des hits les plus actifs (c.-à-d. , AAD355). Dans la série B, il existe deux types de composés; l’un est l’isocoumarine, tandis que l’autre est l’acide cétonique. Les isocoumarines de la série B ont montré une forte interaction entre leur oxygène carbonyle et les résidus His et Arg du site actif. Cette interaction forte pourrait être la base de l’activité de cette classe de composés. L’analyse d’amarrage des céto-acides a conduit à une interaction intéressante de ces composés avec la poche de liaison de l’uréase. Comme l’acide acétohydroxamique, la plupart de ces composés interagissent avec l’uréase d’une manière connue avec les ions nickel. Les oxygènes carboxylates de ces composés pontent les deux ions de nickel.11 Avec l’analyse d’amarrage, nous avons trouvé que les interactions plus favorables pointent vers les acides cétoniques que l’isocoumarine. Cela pourrait être une des raisons de transformer les cétoacides en plus actifs que les isocoumarines (Figures S2a, b dans les Informations de Soutien). Une tendance acceptable entre les énergies de liaison calculées et les activités expérimentales dans les séries individuelles a été observée pour les composés synthétisés (Tableau S2 dans les Informations de Support) .Par ailleurs, une tentative a été faite pour développer une structure triviale et une relation d’activité pour les composés synthétisés. Les composés 8a et n dans la série A et 13a, 14a, 14a, c, e, 16a, c, e, f, i et 17a, d dans la série B étaient dépistage de leurs activités inhibitrices de l’uréase, et les résultats sont présentés dans le tableau S2 de l’information à l’appui. Dans la série A, les composés testés 8h et 8f se sont révélés plus puissants que la norme, et les composés 8b, 8c et 8n ont présenté une activité comparable à la norme, alors que les composés 8a, 8g, 8j et 8l ont montré une très bonne Activités. Les composés 8e, 8i et 8k étaient seulement modérés. Les composés les plus actifs 8h et 8f ont tous deux un atome de brome en tant que substituant en position méta de la partie benzyle, alors qu’ils ont des substituants méthoxy ou méthyle en position para ou méta dans la partie phényle. Les composés 8b et 8c ont un atome de brome avec des substituants en positions ortho et para dans la partie benzyle et méthoxy ou méthyle avec des substituants en position para de la partie phényle, tandis que 8n a des substituants chlore en positions ortho et para dans la partie benzyle et Le substituant méthoxy en position meta dans la partie phényle présentait une inhibition de l’uréase comparable à celle de l’étalon. Ces résultats ont révélé qu’un substituant brome en position méta dans la partie benzyle et méthoxy ou méthyle en position para ou méta dans la partie phényle joue un rôle important dans l’amélioration de l’activité. Les composés 8h et 8f peuvent servir de composés principaux pour une étude plus poussée. Dans la série B, les composés testés 13e, 14b et 14e présentaient une activité modérée d’inhibition de l’uréase, tandis que les composés 13a, d, f, i, 14a, c, f, i, 16c, e, f, et 17a, d présentait une activité faible. Les composés 16a, 16i et 17d ne présentent aucune activité. Parmi les isocoumarines (13a − f, i), 13e présentait une inhibition de l’uréase plus puissante que les autres. Cela pourrait être dû à un substituant chlore à la position méta dans la partie benzyle de 13e. Le reste des composés ont du chlore aux positions ortho (13d) ou para (13f).De même, un substituant brome ou fluor aux positions ortho (13a et 13g), méta (13b et 13h) et para (13c et 13i) dans la partie benzyle n’est pas requis pour une activité optimale. Dans les cétoacides 14a et 1412, les composés 14b et 14e sont plus actifs avec les substituants brome et chlore à la position méta dans la partie benzyle par rapport aux groupes ortho (14a et 14d) et para (14c et 14f). ) positions. Les dihydroisocoumarines 16c, e, f et les thioisocoumarines 17a, d ont montré une faible activité, alors que 16a, i et 17d étaient inactifs. Ces résultats ont révélé que les substitutions chloro et bromo à la position meta dans la partie benzyle jouent un rôle important dans l’amélioration de l’activité. Le composé 14e peut servir de composé principal pour une étude plus poussée. Malgré l’identification de composés ayant de bonnes activités inhibitrices, nous avons encore observé certains composés sans activité (IC50 > 1000 μ M dans le tableau S2 dans l’information de support). Les raisons du manque d’activité de ces composés sont encore à l’étude. En résumé, nous avons réalisé un screening virtuel d’une base de données interne dans le but de trouver de nouveaux inhibiteurs d’uréase. Initialement, nous avons identifié cinq nouveaux composés comme inhibiteurs de l’uréase. Une étude plus approfondie de deux classes d’inhibiteurs a été réalisée. Les activités biologiques et les énergies de liaison de ces composés ont été réalisées contre l’uréase. De cette étude, 34 nouveaux inhibiteurs ont été identifiés avec une corrélation acceptable entre les activités biologiques et les énergies de liaison. Les modes de liaison des composés synthétisés ont été analysés avec les programmes d’amarrage et se sont avérés cohérents, comme indiqué dans des études antérieures.15 En outre, nous avons également réussi à identifier certains composés présentant une activité inhibitrice mieux que la thiourée standard. De futures études permettront de mieux comprendre la structure et les relations d’activité de ces composés. Les résultats présentés jusqu’à présent nous ont permis de conclure que ces composés peuvent être utilisés comme points de départ dans les phases d’optimisation des protéines.